Лазеротерапия: клиническая эффективность и молекулярно-клеточные механизмы

15 августа 2009 г.

Лазеротерапия: клиническая эффективность и молекулярно-клеточные механизмы

Г.И. Клебанов, М.В. Крейнина, М.Г.Мархолия, Т.В. Христофорова, Б.Г. Вайнер

Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), получившее в последнее десятилетие широкое применение в клинической практике в России, в странах СНГ и ряде других зарубежных стран, используется в медицине в двух основных направлениях: 1. при фотодинамической терапии (ФДТ) опухолей, где проявляется поражающий эффект НИЛИ [1,2 ], 2. при лечении широкого круга различных воспалительных заболеваний, лазеротерапия (ЛТ) - стимулирующий эффект НИЛИ [3-5]. Уровень проявлений клинических и фотобиологических эффектов действия НИЛИ определяется вкладом многих факторов: длиной волны ЛИ, мощностью, характером излучения (непрерывное или импульсное) и в том числе способом доставки лазерной энергии. Целью данного обзора является сопостовление клинической эффективности использования различных видов НИЛИ в клинической практике с точки зрения молекулярно-клеточных механизмов лазеротерапии. Лазерное излучение обладает рядом специфических свойств, отличающих его от обычного пусть даже монохроматического света: когерентностью и поляризацией. Существует неверное представление о том, что эти особые свойства ЛИ ответственны за наблюдаемые клинические и фотобиологические эффекты НИЛИ [6,7]. По мере проникновения вглубь биологической ткани (кожа, орган, кровь) когерентность и поляризация ЛИ сохраняется лишь на глубине 200-300 мкм, а далее эти свойства исчезают и распространяется некогерентное и почти неполяризованное, монохроматическое (с одной длиной волны) излучение [6]. Следовательно, благотворные эффекты НИЛИ, отмечаемые при ЛТ различных заболеваний, обусловлены не какими-то особыми свойствами ЛО, а подобны действию обычного неполяризованного и некогерентного света с соответствующей длиной волны излучения, чему есть немало экспериментальных и клинических подтверждений [4,8,9]. В клинической практике наиболее часто используются следующие способы доставки ЛИ на организм при проведении сеансов ЛТ: 1. Внутривенное лазерное облучение крови (ВЛОК) [8,10,11]. 2. Экстракорпоральное облучение крови [12]. 3. Подведение ЛИ к патологическому очагу с помощью эндоскопической техники [8]. 4. Чрезкожное воздействие на болевую точку или проекцию органа [3,8]. 5. Воздействие на рефлекторные точки акупунктуры и зоны Захарьина-Геда [8]. 6. Надвенное облучение крови [5]. Каждый из этих способов ЛО в процессе сеансов ЛТ имеет свои недостатки и преимущества. Но даже беглое сопоставление клинической эффективности ЛТ, проводимой с помощью разных способов доставки ЛИ позволяет заключить, что наиболее оптимальным в клиническом отношении является такой метод, при котором происходит непосредственное взаимодействие НИЛИ с компонентами крови: клетками, липопротеинами и белками. Фотомодификация хотя бы части циркуляторного пула клеток крови, в частности лейкоцитов, за счёт сдвига в уровне их эффекторных функций: продукции различных «сигнальных» веществ, например, цитокинов [13] может быть основой для наблюдаемых в клинике явлений генерализации лечебных эффектов НИЛИ независимо от места локализации воздействия НИЛИ. Так, было показано, что достоверно положительные эффекты в ЛТ стенокардий , инфаркта миокарда и др. патологий были получены при введении световода, через который подводили ЛИ в локтевую вену больного [11]. В случае накожных способов подведения ЛИ, во-первых, уменьшается количество возможных клеток-мишений НИЛИ и во-вторых, за счёт действия различных оптических явлений: отражения, светорассеяния и реабсорбции - доля лазерных фотонов, взаимодействующих с акцепторами световой энергии значительно уменьшается [5]. Вместе с тем, применение ВЛОК сопряжено с определёнными трудностями, существенно ограничивающих широкое использование этого метода: 1. Инвазивность метода, т.е. нарушение целостности кожного покрова, контакт световода с кровью - всё это обусловливает необходимость тщательной и трудоёмкой дезинфецирующей обработки световодов, что само по себе приводит к ухудшению светооптических свойств волокна и повышению его ломкости. 2. Возможность травмы стенки сосуда. 3. Риск скола кончика световода в просвет сосуда. 4. Относительно высокая стоимость световодов. Эти трудности значительно возрастают при использовании ВЛОК в педиатрической практике, где эта процедура усугубляется неблагоприятным воздействием на психику больного ребёнка. Сопостовление недостатков и преимуществ этих двух способов доставки ЛО: ВЛОК и накожных методов привело к необходимости создания некой промежуточной методики ЛО в процессе ЛТ. Так, С.Р. Утц с сотр. разработали не инвазивный, надвенный вариант методики ЛО крови, который позволяет довести до циркулирующей по вене крови ту же энергию, что и в случае ВЛОК. Суть метода состоит в использовании ГНЛ мощностью на выходе световода в 20-25 мВт, т.е. примерно в 10 раз выше, чем при ВЛОК. Конец световода вставляется в штуцер специальной насадки, которая контактирует с кожей над локтевой или кубитальной веной. За счёт лёгкой компрессии поверхностью насадки участка кожи кровоток в мелких сосудах кожи перекрывается, что улучшает проход НИЛИ в вену, а за счёт отражения зеркальной поверхностью насадки отражённое и рассеянное кожей падающее лазерное излучение возвращается назад. Разработанное устройство [5] позволяет увеличить коэфициент пропускания образцов биоткани для ЛО в 2-3 раза. Ранее уже отмечалось, что НИЛИ весьма успешно применяется при лечении многих заболеваний. Анализ данных, имеющихся в литературе, позволяет придти к следующим заключениям: 1.Набор лазерной аппаратуры, спектральный диапазон излучения, методика проведения сеансов ЛТ , диапазон терапевтической дозы ЛО – весьма разнообразны. 2. При проведение ЛТ различных заболеваний на уровне целого организма наиболее часто проявляются следующие клинические эффекты: противовоспалительный, обезболивающий, противоотёчный, регенераторный, иммунокоррегирующий, бактерицидный и др. [3,14] 3. В значительном количестве экспериментальных и клинических работ действие НИЛИ сопровождается улучшением микроциркуляции [15-17], 4. ЛТ ряда заболеваний позволяет снизить, а в ряде случаев отменить применение лекарственную терапию, отмечается улучшение общего состояния организма. [14,18-20], 5. Сопоставление клинических проявлений разных способов доставки ЛИ в процессе ЛТ показало, что наиболее эффективными являются способы прямого взаимодействия НИЛИ с компонентами крови: ВЛОК и надвенная методика [3, 5, 8,14]. 6. Несмотря на то, что ЛТ применяется при лечении широкого круга воспалительных заболеваний, самые убедительные результаты клинического применения НИЛИ с использованием двойного слепого контроля были получены при лазерной терапии раневых процессов, артритов-артрозов и при обезболивании. Такое широкое распространение в клинической практике ЛТ получила благодаря тому, что первичные фотохимические реакции дают разнообразный спектр биохимических, биофизических и физиологических ответов организма, а в клинических эффектах ЛТ находит отражение конечный фотобиологический ответ на ЛО, который проявляется в виде конечной, комплексной реакции органов и систем организма. Логично было бы предположить, что существует некое общее звено в патогенезе всех нозологических форм заболеваний, в терапии которых благотворно проявляется ЛТ. Это подразумевает наличие единого общего механизма действия НИЛИ применительно ко всем патологиям, а не множество разнообразных индивидуальных реакций для каждого конкретного заболевания. Наиболее вероятно, что таким связующим звеном является универсальный патологический процесс, а именно воспаление, которое встречается во всех приведённых примерах применения ЛТ, либо играет роль ведущего патогенетического звена, либо носит реактивный характер. Одной из существенных стадий в патогенезе воспалительного процесса является расстройство микроциркуляции, включая нарушение реологии крови. Воспалительный процесс в своём развитии проходит через смену фаз в цикле(ах) ишемии-реперфузии с нарушением микроциркуляции. Любое воздействие, способное сократить продолжительность ишемической стадии, окажет благотворный эффект на последующее развитие заболевания. Так, при лечении детей с острой дыхательной недостаточностью ГНЛ методом ВЛОК наблюдали улучшение органной и тканевой перфузии увеличение парциального давления кислорода в крови, нормализацию газового и кислотно-основного состояния крови [38]. В эксперименте [15], при формировании ишемии мозга кроликов в результате временной окклюзии сонных артерий наблюдали расстройство микроциркуляции, которое развивалось на первой минуте окклюзии и нарастало по мере углубления ишемических явлений. Предшествующее облучение поверхности мозга ГНЛ приводило к значительному снижению степени микроциркуляторных расстройств и более быстрой нормализации тонуса микрососудов. Кроме этого отмечено, что повторное облучение ГНЛ положительно влияет на регенерацию капилляров и восстановление проходимости микрососудов. Итак, вполне обоснованно можно предположить что влияние излучения ГНЛ на микроциркуляцию является одним из механизмов, обеспечивающих терапевтическое действие ЛО. При этом необходимо учесть важную роль лейкоцитов, которые за счет своей способности продуцировать широкий спектр биологически активных веществ участвуют как в развитии воспалительного процесса, так и регуляции микроциркуляции крови [14-17]. Необходимо учитывать, что внедрение НИЛИ в клиническую практику идет преимущественно эмпирическим путем. Одно из самых коварных свойств НИЛИ - резкая зависимость величины и даже знака эффекта от дозы облучения и функционального состояния биологического объекта. Позитивное стимулирующее действие проявляется, как правило, в узком интервале доз облучения, а затем исчезает или даже сменяется угнетающим действием [13,21,22]. Т.к. до настоящего времени не объяснены механизмы терапевтического действия НИЛИ на организм человека и не определена природа эндогенного хромофора лазерного излучения, до сих пор нет научно-обоснованного метода выбора доз облучения при НИЛТ. В клинической практике в настоящее время существует несколько методик выбора доз облучения для проведения сеансов ЛТ. Так, по реакции сосудов микроциркуляторного русла было установлено, что: n дозы, приводящие к активации микроциркуляторного кровообращения, лежат в пределах до 10 Дж/см2 (терапевтические дозы); n дозы, приводящие к обратимым дисфункциям сосудов - от 10 до 30 Дж/см2; n дозы, приводящие к необратимым расстройствам микроциркуляции - 30 и более Дж/см2 [14]. Эмпирический подход к выбору доз ЛО при проведения процедур ЛТ, а также рекомендациям заболеваний для лечения которых может применяться НИЛИ в итоге может приводить к развитию нежелательных последствий, выражающихся в виде осложнений основного заболевания у определённых категорий больных (синдром «вторичного обострения) [17,21,22]. Лазерная терапия (ВЛОК светом ГНЛ) при стандартной процедуре ЛО больных ишемической болезнью сердца привела к тому, что 66,6% пациентов наблюдалась положительная динамика клинических показателей, у 20,7% пациентов эффект от ЛТ отсутствовал, а у 12,6% больных - происходило учащение приступов стенокардии, снижение толерантности к физической нагрузке и увеличение необходимой дозы нитроглицерина [23]. Иными словами, позитивное стимулирующее действие НИЛИ проявляется, как правило, в узком интервале доз облучения, а затем исчезает или даже сменяется угнетающим действием. Такая ситуация во многом обусловлена отсутствием понимания точного молекулярного механизма или механизмов действия НИЛИ а это приводит к тому, что до сих пор нет научно-обоснованного метода выбора индивидуальной дозы лазерного облучения при проведении сеансов ЛТ. В настоящее время молекулярно-клеточные механизмы лечебного действия НИЛИ обсуждаются в литературе лишь на уровне гипотез. Основным моментом любой гипотезы действия ЛИ на организм является установление первичного хромофора-акцептора энергии поглощённого фотона ЛО и клетки-мишени действия НИЛИ. Дело в том, что взаимодействие лазерной энергии с хромофором основывается на выполнении первого закона фотохимии: действующим является только тот квант, который поглощается. Это означает, что для запуска всех последующих биохимических и физиологических ответов организма при ЛТ необходимо наличие хромофора, способного поглощать строго определённые кванты лазерной энергии, т.е. обладающие совпадением спектра поглощения с длиной волны излучения лазерного источника. Наиболее широко в медицине и биологии в настоящее время используется гелий-неоновый лазер (ГНЛ), длина волны излучения которого составляет 632,8 нм, Применительно к этому источнику лазерной энергии в литературе высказывается предположение, что хромофорами в красной области спектра могут быть: n порфирины и его производные [24,25], n молекулы ферментов- антиоксидантов: СОД, каталаза, церулоплазмин [6,26], n компоненты дыхательной цепи митохондрий: флавопротеины и цитохромы [25], n молекулярный кислород [27,28], n тетрагидробиоптерин [29]. Что касается гипотез фотобиологического действия НИЛИ, то в литературе рассматривается несколько предположений механизма действия ЛИ: 1. реактивация металлосодерждащих ферментов-антиоксидантов [6,26,30,31], 2. гипотеза о взаимодействии ЛИ с компонентами цепи транспорта электронов в митохондриях [25], 3. неспецифическое влияние на биополимеры [32], 4. фотовозбужденное образования синглетного кислорода [33], 5. неспецифическое влияние на структуру воды [28]. Рассмотрим каким образом данные гипотезы объясняют механизмы терапевтических эффектов НИЛИ. Согласно одного из предположений о механизме стимулирующего действия НИЛИ на биологические объекты считается, что акцепторами излучения ГНЛ, способными поглощать свет с его длиной волны излучения (632,8 нм), могут быть железо- и медь-содержащие ферменты, такие как супероксиддиcмутаза (СОД), каталаза, церулоплазмин [6,26,30,31]. Инактивация данных энзимов наблюдается при состояниях, связанных с ишемией, гипоксией, воспалением. Суть гипотезы заключается в том, что ЛО реактивирует важные металлсодержащие ферменты, участвующие в антиокислительных процессах. Данная гипотеза объясняет противовоспалительные эффекты НИЛИ. Известно, что СОД и каталаза способны перехватывать активные формы кислорода, которые участвуют в развитии воспалительного процесса. Однако данное предположение о механизме действия НИЛИ требует дальнейшего изучения, т. к. экспериментальных доказательств в настоящее время собрано немного. Суть гипотезы, предложенной Т. Й. Кару, о взаимодействии ЛО с компонентами цепей переноса электронов [25] сводится к тому, что хромофорами света ГНЛ в организме человека могут быть цитохромы а и а3, цитохромоксидаза. Механизм действия ЛИ в рамках этой гипотезы подразумевают такую последовательность событий: 1. При гипоксии в условиях недостатка кислорода происходит восстановление ферментов-переносчиков в дыхательной цепи и падение трансмембранного потенциала митохондрий. 2. ЛО приводит к реактивации этих ферментов (например, цитохромоксидазы), что восстанавливает поток электронов в дыхательной цепи и формирует трансмембранный потенциал митохондрий, т. е. происходит возрастание трансмембранного потенциала в митохондриях, увеличение продукции АТФ в клетках, активация транспорта Са2+. Увеличение продукции АТФ и концентрации ионов Са2+ в клетке приводит к стимуляции внутриклеточных процессов. Данная гипотеза о механизме действия НИЛИ предлагает продуманную и вполне обоснованную цепь событий, которая возможно реальна. Авторы опираются на данные об увеличении пролиферации различных клеток, о лазер-индуцированном респираторном взрыве фагоцитов, наблюдаемом in vitro и т. п., то есть на фактах, которые могут быть следствием, а не причиной эффектов НИЛИ. Кроме того, с помощью этой гипотезы трудно объяснить дистанционность и пролонгированность эффектов НИЛИ, отмечаемых в клинике. Авторы гипотезы о неспецифическом влиянии НИЛИ на биополимеры [32,33] считают, что облучение светом ГНЛ приводит к изменению заряда белков крови, их конформационного строения и в результате функционального состояния и в итоге, к изменению процессов, в которых эти белки участвуют, например, транспорта различных веществ. В данном случае непонятно, что же является акцептором ЛИ. Кроме того, авторы не описывают физиологические эффекты НИЛИ, возникновение которых может быть объяснено в рамках этой гипотезы. Авторы предположения о неспецифическом влияние ЛО на структуру воды [33] считают, что НИЛИ изменяет “кластерную” структуру воды. Из самых общих соображений можно предположить, что в результате изменяются гидрофобные взаимодействия белков, а следовательно и процессы в которых эти белки участвуют. Основным недостатком теорий о неспецифическом влиянии ЛО на структуру воды и на биополимеры является их умозрительность и отсутствие экспериментальных доказательств как in vitro, так и in vivo. Итак, многие из существующих в настоящее время гипотез о механизмах терапевтического действия НИЛИ имеют недостатки, которые можно разделить на две группы. Во-первых, часть авторов рассматривают эффекты НИЛИ, без учета наличия хромофора. Очевидно, что поиск акцептора ЛИ является наиболее важным в проблеме действия НИЛИ. Во-вторых, некоторые предположения о механизмах действия лазерного излучения не подтверждены экспериментальными данными или же эти данные противоречивы. Ранее на кафедре биофизики РГМУ была сформулирована гипотеза о фотодинамическом механизме действия НИЛИ [34-37]. Ее основные положения можно представить следующим образом : 1. Хромофорами лазерного излучения в красной области спектра являются эндогенные порфирины, которые способны поглощать свет в этой области спектра и хорошо известны как фотосенсибилизаторы. Содержание порфиринов в организме увеличивается при многих заболеваниях и патологических состояниях человека. Мишенями лазерной энергии являются клетки, в частности лейкоциты, и липопротеины крови, содержащие порфирины. 2. Порфирины, поглощая световую энергию НИЛИ, индуцируют фотосенсибилизированные свободнорадикальные реакции, приводящие к инициации перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах лейкоцитов и в липопротеинах с образованием первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Накопление в мембранах продуктов ПОЛ, в частности гидроперекисей, способствует увеличению ионной проницаемости и в том числе для ионов Са2+ . 3. Увеличение содержания ионов Са2+ в цитозоле лейкоцитов запускает Са2+-зависимые процессы, приводящие к праймингу клеток [35,36,37], что выражается в повышении уровня функциональной активности клетки, к повышенной продукции различных биологически активных соединений (оксид азота, супероксид-анионрадикал, гипохлорит-анион и др.). Некоторые из них обладают бактерицидным эффектом, а также способны влиять на микроциркуляцию крови. Например, оксид азота является предшественником так называемого Endothelium Derived Relaxing Factor (EDRF), фактора, расслабляющего эндотелий сосудов, который приводит к вазодилятации последних и улучшению микроциркуляции, что является основой для большинства благотворных клинических эффектов ЛТ [11,15,38]. В лейкоцитах за синтез оксида азота (NO.) ответственна т.н. индуцибельная NO-синтаза (iNOS) [39]. К образованию этого фермента в лейкоцитах может приводить целый ряд различных стимулов (цитокины, липополисахарид и др.) при этом происходит индукция mРНК NO-синтазы. Механизм синтеза NO-синтазы в фагоцитах недостаточно изучен. Однако в литературе высказывается мнение о том, что появление индуцибельной NO-синтазы в фагоцитах есть результат внутриклеточного образования небольшого количества радикалов кислорода, которые запускают процеесс синтеза целого ряда белков: цитокинов, СОД, каталазы и в том числе NO-синтазы [39]. In vivo образование индуцибельной NO-синтазы может происходить в фагоцитах, находящихся в патологически измененных тканях, например, в очаге воспаления где клетки уже прошли этап примирования. В дальнейшем, в процессе проведённой экспериментальной работы удалось получить результаты, доказывающие правомочность некоторых высказанных постулатов фотодинамической гипотезы механизма действия НИЛИ [34-37]. Показано, что: 1. ЛО суспензии фагоцитов вызывает прайминг клеток, выражающийся в том, что после ЛО последующая стимуляция лейкоцитов сопровождается увеличением продукции активных форм кислорода, что измерялось с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции. Эффективность проявлений прайминга лейкоцитов зависела как дозы ЛИ, так и от концентрации порфиринов. 2. ЛО суспензии фагоцитов в дозах, вызывающих прайминг, приводило к увеличению концентрации ионов кальция в цитозоле клеток. 3. Получены предварительные результаты, свидетельствующие о том, что ЛО лейкоцитов при определённых условиях сопровождается увеличением продукции NO. 4. Показано, что существует определённая корреляция между исходной чувствительностью лейкоцитов крови больного к действию ЛО in vitro и клинической эффективностью проводимой ЛТ. Итак, в основе свободнорадикального или фотодинамического механизма стимулирующего действия НИЛИ лежит фотосенсибилизированное образование АФК с участием эндогенных фотосенсибилизаторов, предпочтительно порфиринов, что приводит к формированию прайминга лейкоцитов. Суть явления прайминга состоит в подготовке лейкоцитов к выполнению своих функций и в частности к реализации кислород-зависимого фагоцитоза. На молекулярном уровне явление прайминга включает в себя два основных события: сборку компонентов мембраносвязанной NADPH-оксидазы, ответственной за продукцию АФК фагоцитами и экспрессию рецепторного аппарата [40,41]. Всё это вместе взятое увеличивает функциональный потенциал лейкоцитов, что реализуется при последующей после прайминга стимуляции лейкоцитов в виде большей продукции АФК и других прооксидантов, различных цитокинов, липидных медиаторов и др. продуктов жизнедеятельности клеток. В частности увеличение продукции АФК и гипохлорита определяет увеличение бактерицидности фагоцитов. Са2+-зависимый праминг фагоцитов обладает несколькими особенностями: - минимальное время формирования прайминга невелико и составляет 2-3 мин, - увеличение функционального потенциала клеток при этом не превышает 2-4 раза, - формирование прайминга не зависит от присутствия ингибиторов синтеза белка, т.е. сборка NADPH-оксидазы и экспрессия поверхностных рецепторов не является результатом синтеза белка de novo. [39]. Кроме этого НИЛИ может вызывать и более значительные в плане уровня функциональной активности эффекты в лейкоцитах, затрагивающие синтетический аппарата клеток, НИЛИ может индуцировать синтез белков и пролиферацию лейкоцитов [39,42]. Это обстоятельство имеет прямое отношение к лазер-индуцированной регуляции микроциркуляции крови за счёт действия оксида азота (NO), который является предшественником фактора, расслабляющего эндотелий сосудов (EDRF) [43]. Дело в том, что NO является продуктом активности специфического фермента NO-синтазы (NOS), который катализирует реакцию окисления аргинина до цитрулина и оксида азота. NOS в организме человека и животных присутствует по крайней мере в 2х изоформах: конституционная (с NOS), которая присутствует в клетках эндотелия, фибробластах, клетках глии и др. с момента их образования и т.н. индуцибельная (iNOS ) или лейкоцитарная. В исходных не активированных лейкоцитах NOS отсутствует; она появляется, индуцируется в процессе дополнительной стимуляции лейкоцитов. Механизм подобной стимуляции, приводящей к образованию индуцибельной NOS, в последнее время привлекает к себе большое внимание и в общих чертах он расшифрован (рис 1)[39]. Оказалось, что для того, чтобы запустить синтез белков и в том числе NOS в лейкоцитах в клетке должно образоваться некоторое количество цитозольного дипептида, т.н. NF-kb ( ядерный фактор, белок группы и, впервые найденный в b-лимфоцитах) В исходных клетках этот фактор присутствует в неактивном состоянии в виде тримера, состоящего из двух пептидов самого фактора и третьего пептида, который является его ингибитором. При действии любого индуктора синтеза белка в лейкоцитах, в клетке образуется небольшое количество АФК, в частности Н2О2, которые индуцируют с помощью внутриклеточных протеаз, диссоциацию исходного тримера в димер с выходом из комплекса ингибитора (Ikb) и переводом NF-kb в активное состояние. При этом NF-kb диффундирует из цитозоля в ядро, активирует ген, запускает транскрипцию с образованием соотвествующих m-РНК, которые затем выходят в цитоплазму и на рибосомах запускается синтез соотвествующих белков: iNOS, СОД, каталазы, цитокинов и др. Иными словами, первичной стадией запуска синтеза белков в лейкоцитах является внутриклеточное образование небольшого (микромоли) количества АФК. Возвращаясь к механизму стимулирующего действия НИЛИ можно предположить, что (рис.1) за счёт инициации фотосенсибилизированных СРР с участием эндогенных порфиринов в клетке может образовываться некоторое количество АФК, которые затем воздействуя на NF-kb, запускают синтез белков, включая iNOS, различные цитокины. Таким образом, лазер-индуцированный фотосенисибилизированный прайминг лейкоцитов, вызывая вазодилятацию ранее стазированных и формирование новых микрососудов, способствует ускорению стадии реперфузии, восстановлению кровотока и нормализации снабжения ишемизированного органа кислородом. Но кроме этого нормализация кровоснабжения может вызывать восстановление доставки в очаг воспаления обычных лекарств, применяемых в терапии данного заболевания, которые ранее не проходили из-за блокирования кровотока. Всё это вместе взятое и обусловливает благотворные эффекты НИЛИ при проведении сеансов ЛТ в процессе лечения различных воспалительных заболеваний. Лазер-индуцированное улучшение микроциркуляции крови показано с использованием различных методических приёмов: Доплер флоуметрией , измерением наполняемости микрососудов кровью, определением гиперемии. В настоящее время для определения изменений в гиперемии можно использовать измерение теплопродукции с помощью различных тепловизоров [44,45],позволяющих измерять с высокой чувствительностью теплопродукцию различных приповерхностных частей тела Метод тепловидения, основанный на дистанционном измерении распределения поверхностной температуры, пришел в медицину в середине 50-х годов и в настоящее время хорошо известен [46,47]. Главная отличительная черта тепловидения при изучении живых объектов состоит в том, что метод дает возможность объективно зафиксировать изменение интенсивности тепловыделения, которое, в свою очередь, влияет и на теплообмен [47,48]. Тепловидение привлекает к себе такими свойствами, как обзорность, неинвазивность, абсолютная безвредность и необременительность для обследуемого, дает возможность оперативно, за секунды, получить температурный образ, отражающий текущее состояние всего организма или его части. В настоящей работе для проведения экспериментов по тепловизионному контролю, сопровождающему действие на ткани магнито-инфракрасно лазерного аппарата МИЛТА-01 (М1) (в настоящее время выпускаемого под названием РИКТА), был использован матричный компьютерный тепловизор ТКВр-ИФП. Данный прибор по своему устройству и особенностям программного обеспечения ориентирован, главным образом, на решение задач медицинской диагностики и косметологии [49,50], он прошел клинические испытания и рекомендован Минздравом РФ к применению в медицинской практике, производится в г.Новосибирске Институтом физики полупроводников Сибирского отделения РАН. Некоторые технические характеристики тепловизора отображены в Таблице 1. Табл.1. Технические характеристики тепловизора ТКВр-ИФП. Дискретность кадра 128 x 128 пикселей Характерное время получения и отображения на экране одной термограммы 0.05 сек Характерная рабочая длина волны 2,9 мкм Диапазон измеряемых температур 20 - 41 0С Предельная чувствительность 0.030С при температуре объекта около 300С . Хладоагент Жидкий азот Время непрерывной работы при однократной заправке жидким азотом более 10 часов На рис.2,3 приведены две последовательные серии термограмм лица, полученные в экспериментах с воздействием аппарата МИЛТА на область носа одного и того же обследуемого. Терминал аппарата помещался на расстоянии около 1-2 см справа от носа. Тепловизионная камера регистрировала тепловое изображение с поверхности носа волонтёра со стороны, противоположной терминалу. Как видно из рис. 2 уже в процессе первого сеанса лазерного облучения температура поверхности носа, противоположной облучаемой поверхности, начинает возрастать, достигая в конце сеанса облучения 280 С. Увеличение температуры повехности продолжало расти и после завершения лазерного воздействия. Так, спустя 2 мин после завершения первого сеанса облучения температура достигла 30,20 С. Вторая серия экспериментов была проведена в том же режиме облучения и на том же участке лица волонтёра, что и предыдущий эксперимент, но спустя 7 мин после окончания 1 эксперимента (рис.3). Оказалось, что период времени между концом облучения первого эксперимента и началом второго сеанса температура поверхности носа увеличивалась и достигла к началу второго сеанса почти 360С и почти не изменялась в процессе второго сеанса облучения. Это может свидетельствовать о том, что: А. лазерное облучение поверхности кожи лица, по-видимому, запустило процессы вазодилятации микрососудов, увеличения микроциркуляции и теплопродукции, Б. Эффект увеличения теплопродукции реализовался не мгновенно, «под лучом», а через некоторый латентный период, В. Увеличение теплопродукции поверхности носа волонтёра имело предельный характер, т.е. увеличилось до 36,30С Таким образом, проведенные эксперимнты показали, что ЛО вызывает увеличение теплопродукции участка кожи лица и это увеличени можно зафиксироваить с помощью тепловизоров. Ранее уже указывалось, что наиболее яркие эффекты применения НИЛИ в клинике обнаружены при лазеротерапии раневого процесса.. Нормальный процесс заживления ран проходит через несколько перекрывающихся во времени, но взаимосвязанных стадий: воспаление, формирование гранулемы, восстановление поверхности раны и др. [51,52]. Этот процесс требует взаимодействия различных клеток (лейкоцитов, фибробластов, эндотелиальных клеток дермы и эпидермиса), равно как и активации различных химических медиаторов (цитокины, внутриклеточные продукты, активные формы кислорода и др.), продуцируемые лейкоцитами, фибробластами и кератиноцитами [51,52]. Если химические реакции, протекающие в процессе заживления ран, воздействуют друг на друга, то можно предположить, что каждая стадия заживления ран служит необходимым предшественником следующего этапа. Это находит своё отражение в смене популяций различных клеток в очаге, сменяющих друг друга на разных стадиях процесса заживления раны. Каждая из этих популяций имеет свою конкретную задачу: А. нейтрофилы, продуцирующие большое количество прооксидантов и осуществляющих фагоцитоз для очищения раневой зоны от остатков погибших клеток; Б. мононуклеарные клетки, участвующие в фагоцитозе и продуцирующие большое количество цитокинов, которые в свою очередь пролиферацию клеток и формирование новых микрососудов, В. Фибробласты, синтезирующие коллаген и обеспечивающие тем самым рубцевание, Г. эндотелиальные клетки дермы и эпидермиса, миграция и пролиферация которых обеспечивает закрытие кожного окна раны [51,52]. В случае нагноения нормальный процесс заживления ран «отягчается» влиянием микрофлоры, действием бактериальных эндотоксинов, выражающееся в ингибировании функциональной активности лейкоцитов, что задерживает протекание дальнейших стадий заживления ран. Поэтому лечение гнойных ран должно включать в себя дополнительную стадию уменьшения бактериальной обсеменённости раны, уменьшения титра эндотоксинов и ингибирования лейкоцитарных функций после чего происходит нормализация процесса заживления и очерёдности смены фаз процесса. Рассмотрим каким образом проявляется благотворное влияние НИЛИ на разные стадии процесса заживления ран. I. Воспаление В условиях асептической раны на этой стадии процесса происходит формирование ишемии и максимальная активация систем, продуцирующих АФК и образование радикалов-инициаторов ПОЛ. В какой-то мере этот процесс полезен тем, что направлен на очищение зоны некроза от дебриса погибших клеток. Однако при этом происходит инактивация сбалансированной системы антиоксидантной защиты, что может приводить к поражению клеток не только в зоне раневого дефекта, но и в перифокальной области. Чаще всего гиперпродукция АФК и Fe2+ приводит к задержке последующих стадий раневого процесса. Ситуация ещё более осложняется при инфицировании зоны поражения. Прежде всего на первом этапе инфицирования при высоком уровне обсеменённости бактериальные эндотоксины, обладая свойством хемоатрактантов, будут способствовать усилению миграции фагоцитов в зону поражения и увеличению продукции ими АФК. НИЛИ оказывает благотворное действие на процесс заживления ран на стадии воспаления по нескольким направлениям: А. В случае недостаточной активности фагоцитов НИЛИ за счёт формирования кратковременного прайминга может увеличивать бактерицидность фагоцитов, что будет проявляться в более эффективной дезинфекции раневого дефекта и очистке от остатков погибших клеток. Б. В результате фотосенсибилизированной индукции синтеза iNOS и увеличения продукции NO НИЛИ будет вызывать вазодилятацию ранее стазированных микрососудов и улучшение микроциркуляции крови, что будет способствовать: -реперфузии и увеличению содержания кислорода в ишемизированной области раневого дефекта, -улучшению доставки в ишемизированную область раневого дефекта лекарственных препаратов, обычно применяемых для лечения ран, -быстрейшей смене популяций лейкоцитов в ране, когда популяция гранулоцитов сменяется на популяцию мононуклеарных лейкоцитов, способных продуцировать различные цитокины, например IL-1, IL-6, которые индуцируют синтез коллагена и пролиферацию фибробластов. В. Известно, что при большой концентрации эндотоксинов наблюдается ингибирование функциональной активности фагоцитов. Поэтому в случае инфицирования развитие последующих стадий заживления ран задерживается. Вот почему возникает необходимость предпринимать различные меры по дезинфекции ран. Одним из таких подходов может быть применение высокоэнергетического лазерного излучения, с помощью которого происходит «выпаривание» некротических тканей и дезинфекция раны. Последующая обработка раневой поверхности НИЛИ будет способствовать репарационному процессу уже как бы в асептических условиях [51,52]. II. Активация синтеза коллагена и пролиферация клеток. Индукция синтеза коллагена фибробластами – необходимый этап заживления ран, может быть достигнута двумя путями: А. прямое действие НИЛИ на фибробласты с участием активации NF-kb, транскрипционного фактора фибробласта. Так, в работе Reddi e.a. [53] показано, что лазерное облучение в красном диапазоне спектра Ахилесова сухожилия кроликов в дозе 1,2 Дж/см2 в течение 14 дней приводило к увеличению концентрации коллагена в клетках примерно на 30%. При действии НИЛИ с l=660 нм и дозой 2,4 и 4 Дж/см2 на монослои культуры фибробластов наблюдали значительный рост клеток [54]. Б. Индукцию синтеза коллагена и пролиферацию фибробластов могут вызывать различные цитокины, продуцируемые лейкоцитами, синтез которых вызывается при действии НИЛИ [55]. III. Реэпителизация раневой поверхности. Наработка различных сигнальных молекул (цитокинов) на предыдущих стадиях раневого процесса, индуцирует трансформацию исходных клеток эпидермиса, в частности кератиноцитов (Кц) в клетки, способные не только к делению, к миграции но и к собственной продукции различных протеаз и адгезионных молекул, которые в свою очередь индуцируют инфильтрацию их в поражённый эпителиальный матрикс и реэпителизацию раневой поверхности. Для того, чтобы установить может ли НИЛИ оказывать влияние на свойства кератиноцитов авторы цитируемой работы [52] использовали клеточную модель, монослой Кц Эффект ранения Кц достигался путём соскабливания участка монослоя клеток. Было показано, что лазерное облучение ГНЛ дозой 1,5 Дж/см2 сопровождалось заживлением поражённого участка монослоя Кц. Кроме этого методами молекулярной биологии было показано, что ЛО монослоя Кц вызывало активацию NF-kb фактора и пролиферацию этих клеток. ЛО интактных Кц не проводило к образованию NF-kb в активном состоянии. Что же касается механизма лазер-индуцированной активации транскрипционного фактора NF-kb в цитоплазме Кц и его транслокации в ядро с последующей активации синтеза белков, то этот процесс имеет свободнорадикальную природу [39] и может индуцироваться при действии НИЛИ с участием различных эндогенных фотосенсибилизаторов: порфиринов или цитохромов . В работе Grossman e.a. [56] пролиферацию Кц индуцировали излучением низкоинтенсивного диода с l= 780 нм. Было обнаружено, что облучение монослоя Кц сопровождается пролиферацией клеток, определяемой по включению 3 Н –тимидина. Облучение в интервале доз 0,45-0,95 Дж/см2 в 1,3-1,9 раз увеличивало пролиферацию Кц по отношению к контролю. Ввеление в монослой клеток ферментативных перехватчиков АФК (СОД, каталаза), перехватчиков липидных радикалов (витамин Е), неферментативных перехватчиков АФК (аскорбат, азид натрия, гистидин, манитол) ингибировало лазер-индуцированную пролиферацию Кц. Таким образом, НИЛИ за счёт фотосенсибилизированной инициации внутриклеточных СРР активации синтеза, пролиферации, миграции клеток эпидермиса, способствует реэпителизации и закрытию раневого дефекта. Большинство обнаруженных эффектов благотворного действия НИЛИ в клинике и в эксперименте были получены при использовании гелий-неонового лазера с l=632,8 нм, т.е. с излучением в красной области спектра, для которого в качестве первичного хромофора предполагаются эндогенные порфирины. Однако, в клинической практике нашло широкое применение НИЛИ в инфракрасном диапазоне спектра. (ИКЛО). Для понимания механизма лечебного действия ИКЛО очень важно иметь экспериментальные доказательства схожести эффектов действия ИКЛО и ГНЛО на клеточные и молекулярные модели in vitro и в частности на лейкоциты. Действительно, в последнее время было обнаружено, что ИКЛО суспензии лейкоцитов крови приводит к формированию кратковременного прайминга фагоцитов очень похожего на прайминг клеток, вызываемый действие ГНЛО. Кроме этого следует указать на работы, в которых была предпринята попытка изучить спектр действия НИЛИ на функциональную активность клеток. Так, в работе [57] монослои культуры различных клеток подвергали монохроматическому облучению с l= 410, 488, 630, 635, 805 и 1064 нм. Было обнаружено, что скорость митотической активности нормальных и раковых уротелиальных клеток увеличивалась при облучении в дозе 4,8 Дж/см2 при следующих длинах волн: 410, 635 и 805 нм. Облучение монослоя клеток в других спектральных интервалах не приводило к увеличению митотической активности клеток. Иными словами, наблюдается хорошее совпадение спектральных интервалов фотобиологического эффекта со спектром поглощения порфиринов. В другой работе [58] изучали влияние НИЛИ с l=488-514 нм (Аргоновый лазер) и с l=670 нм (Криптоновый лазер) на скорость заживления ран крыс. Было обнаружено, что при одинаковых дозах воздействия (20 Дж/см2) наиболее эффективное заживление ран наблюдалось при действии НИЛИ в синей области спектра по отношению к облучению с l=670 нм. Разница в эффективности лечебного эффекта становится понятной, если учесть, что в синей области спектра порфирины обладают значительно большей способностью к поглощения света по сравнению с красной областью спектра. Приведённые данные литературы свидетельствуют о том, что НИЛИ в инфракрасном диапазоне может оказывать такие же эффекты на молекулярном и клеточном уровнях организации объекта исследования. Что же касается первичных хромафоров для ИКЛО, то ими могут быть: - цитохромы дыхательной цепи митохондрий [25], - тетрагидроптерины [29], - и возможно продукты деградации эндогенных порфиринов. Таким образом, подводя итог рассмотренным в этой главе данным литературы можно придти к следующим заключениям: 1 Возникновение и заживление ран, один из примеров воспалительных патология, сопровождается активацией систем, ответственных за продукцию АФК и высвобождение каталитически активных ионов двухвалентного железа, что является необходимым и достаточным условием для активации СРР ПОЛ 2. Гиперпродукция АФК и радикалов-инициаторов ПОЛ приводит к поражению клеток раневого дефекта и клеток перифокальной зоны, что задерживает протекание дальнейших стадий раневого процесса. В этой связи применение экзогенных антиоксидантов будет оказывать благоприятное действие на процесс заживления ран. 1. НИЛИ за счёт индукции синтеза и пролиферации фибробластов и клеток эпидермиса способствует ускорению процесса заживления ран. 2. В условия инфицирования лазерное облучение высокой мощности или НИЛИ в присутствии экзогенных фотосенсибилизаторов будет способствовать дезинфекции ран и тем самым ускорению раневого процесса.